任一平：液質(zhì)技術(shù)在食品微量蛋白質(zhì)定量中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)作為人類機(jī)體的重要組成部分，是生命活動的主要承擔(dān)者。人們在日常生活中也習(xí)慣性的將蛋白質(zhì)的攝入量作為健康飲食的重要指標(biāo)。2018年6月23日，由國聯(lián)股份(832340)、食品安全與檢測傳媒事業(yè)部主辦的“2018年第十一屆中國食品安全檢測技術(shù)高峰論壇暨首屆新技術(shù)、新產(chǎn)品、新工藝及優(yōu)秀工程師推薦評選活動”在杭州盛大召開。浙江清華長三角研究院國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估中心總工程師任一平做了題為《液質(zhì)技術(shù)在食品微量蛋白質(zhì)定量中的應(yīng)用》的報(bào)告，就高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在微量食品蛋白質(zhì)檢測中的創(chuàng)新性運(yùn)用做了詳細(xì)的闡述。

在報(bào)告中，任一平介紹到，目前學(xué)界對食品中蛋白質(zhì)定量檢測分為五種：一是營養(yǎng)功能性蛋白質(zhì)的定量，主要指各種動物或人母乳的乳白蛋白，血清蛋白，乳鐵蛋白等；二是食品過敏性蛋白質(zhì)的定量與產(chǎn)品標(biāo)識，以植物性的花生、大豆、木瓜、堅(jiān)果和動物的牛奶，甲殼動物，魚和蝦等；三是食品中不同來源蛋白質(zhì)的定性與定量，包括羊奶制品中其他動物奶的定性與定量，羊肉中狐貍?cè)獾蔫b別等；四是致病性微生物毒性蛋白質(zhì)的定性與定量，主要有金黃色葡萄球菌腸毒素A，B和C1型以及肉毒素等；五是致毒蛋白質(zhì)的定量，包括蘑菇和藻類毒素。關(guān)于大分子的研究歷程也由1980年代的基因組學(xué)、1990年代的蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展到21世紀(jì)的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)。
 

所謂的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)指的是把一個(gè)基因組表達(dá)的全套蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系中特定的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定的一門學(xué)科。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測對象是針對已確定的目標(biāo)蛋白質(zhì)，通過將已知的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫與蛋白酶特異性酶切技術(shù)相結(jié)合，篩查和選擇適合的特異肽段，進(jìn)而在三重四級桿質(zhì)譜中運(yùn)用選擇反應(yīng)檢測(SRM)或多反應(yīng)檢測模式(MRM)建立相應(yīng)的定量檢測方法。
 

任一平指出，近年來，在乳品行業(yè)的食品安全事故頻發(fā)，例如三聚氰胺導(dǎo)致的“結(jié)石門”、劣質(zhì)奶粉引起的“大頭娃娃”事件……因此，在GB 10765-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方產(chǎn)品中規(guī)定，乳基嬰兒配方食品中乳清蛋白含量必須滿足“≥60%”的設(shè)定。在新國標(biāo)第二法中，有5種(或3種)氨基酸判定法。其基本原理是將樣品通過鹽酸水解過濾后，與N-羥基琥珀酰亞胺-活性雜環(huán)氨基甲酸酯(AQC)衍生。衍生物用液相色譜儀分離、紫外檢測器檢測，分別測定出其中的五種氨基酸(胱氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸)的含量。根據(jù)乳清蛋白占乳蛋白60%時(shí)所對應(yīng)的上述氨基酸的臨界值，綜合判定乳清蛋白占乳蛋白的含量是否達(dá)到60%。然后利用五種安吉全的測定值分別進(jìn)行單項(xiàng)判定，最后，上述五種單項(xiàng)判定結(jié)果中以三種及三種以上相同的判定為最終判定結(jié)果。
 

在首次使用液相色譜—單四級桿質(zhì)譜法進(jìn)行研究時(shí)，由于沒有考慮熱變性的蛋白部分，導(dǎo)致他們的方案被否決。任一平和其團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上再次展開了研究。這次研究的主要內(nèi)容集中在特異(指紋)肽段的尋找(蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的查詢與運(yùn)用)、色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化與確定(TQ的MRM的應(yīng)用)、酶解條件的優(yōu)化、特異肽段的特異性驗(yàn)證與確認(rèn)(Q-TOF的全掃描)、內(nèi)標(biāo)特異肽的設(shè)計(jì)與合成、同位素內(nèi)標(biāo)物的設(shè)計(jì)與合成以及方法學(xué)驗(yàn)證與樣品檢測應(yīng)用上。在會議上，任一現(xiàn)場就如何進(jìn)行特異肽的確認(rèn)、選擇內(nèi)標(biāo)的原則等做了詳細(xì)的闡述。
 

在通過與專家的討論后，最終肯定了乳清蛋白“高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法”的科學(xué)性、合理性和創(chuàng)新性。任一平指出，引入蛋白組學(xué)的概念是技術(shù)上的進(jìn)步，它解決了熱變形蛋白的測定問題。由于此方法在技術(shù)層面較為先進(jìn)，對實(shí)驗(yàn)操作人員要求較高，專家建議起草人對方法操作步驟應(yīng)進(jìn)一步提高和完善，明確標(biāo)準(zhǔn)品信息以便推廣使用，理順標(biāo)準(zhǔn)中兩個(gè)方法的關(guān)系，提供數(shù)據(jù)驗(yàn)證兩種方法測定結(jié)果的可比性，進(jìn)一步核實(shí)轉(zhuǎn)化系數(shù)0.6。
 

在報(bào)告的最后，任一平對高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行了小結(jié)與展望：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法依據(jù)蛋白組學(xué)分析的理念與數(shù)據(jù)庫，引入酶解、串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，運(yùn)用同位素標(biāo)記短肽內(nèi)標(biāo)法定量，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度優(yōu)，選擇性好的特點(diǎn)，已經(jīng)成功地運(yùn)用到乳制品中牛α-乳白蛋白含量的檢測，為原料的質(zhì)量提高技術(shù)保障。同時(shí)適用于不同含量產(chǎn)品中牛α-乳白蛋白的檢測，為產(chǎn)品提供技術(shù)支持。

目前該方法已經(jīng)成功運(yùn)用于真假羊奶的鑒別與定量、貝塔酪蛋白變異體的定量、花生過敏原的殘留定量和母乳中微量蛋白的定量等。